引言

甘草（Licorice）是我国传统中药材的重要代表，其药用价值主要来源于甘草酸、黄酮类化合物等活性成分。活性成分的生物合成受MYB、bHLH、WRKY等转录因子家族调控。研究表明，甘草酸合成关键酶基因CYP88D6和CYP72A154的表达受到MYB和bHLH转录因子的直接调控，而黄酮类化合物的合成则与WRKY、NAC等转录因子密切相关。

转录因子为基因表达调控的关键分子，在次生代谢中识别特定DNA序列调控下游基因的表达发挥作用。研究发现bHLH家族成员GibHLH9、GibHLH53和GibHLH174通过激活甘草酸合成关键基因GiCSyGT和GiUGT73P12表达促进甘草酸积累。R2R3-MYB转录因子AtMYB12的过表达使甘草毛状根中总黄酮含量提高3倍，甘草查尔酮A（LCA）含量提高5倍。

随着高通量测序技术和生物信息学的发展，通过转录组测序技术能系统分析不同环境胁迫和激素处理下甘草转录因子表达模式。研究发现DREB转录因子GuDREB35通过激活黄酮生物合成途径增强甘草耐旱性，NAC转录因子家族成员参与调控茉莉酸甲酯和盐胁迫诱导的甘草次生代谢过程。

本文旨在总结甘草转录因子的最新研究成果，探讨其在甘草品质改良和分子育种中的应用潜力。随着甘草基因组数据的不断完善以及基因编辑等分子生物学技术的快速发展，其深入研究为解析甘草活性成分合成的分子机制提供新视角，为通过代谢工程手段提高目标活性成分含量 培育高产优质甘草新品种奠定基础。

1 甘草转录因子的分类与结构特征

1.1主要转录因子家族及其分布

甘草中已鉴定的转录因子主要包括MYB、bHLH、bZIP和DREB等家族，这些转录因子家族在甘草基因组中呈现特异性分布模式。研究表明，MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，在甘草中参与调控黄酮类化合物的生物合成。bZIP家族在甘草基因组中共鉴定出66个成员，根据系统进化分析可分为13个亚家族，这些成员在基因结构和保守结构域上表现出亚家族特异性。DREB家族在甘草基因组中鉴定出79个成员，分为6个主要组别，这些成员在应对非生物胁迫特别是干旱胁迫中发挥重要作用。不同家族的转录因子在甘草不同组织和发育阶段表达具有显著差异，例如bZIP家族成员在根、茎、叶等组织中表现出明显的组织特异性表达模式。甘草转录因子家族存在明显的扩张现象，这种扩张现象可能与甘草特殊次生代谢途径的进化相关，如黄酮类化合物的合成。

1.2结构域特征与DNA结合特性

甘草转录因子各家族具有独特的结构域特征和DNA结合特性。MYB家族含有保守的MYB结构域，通常由1-4个不完全重复组成，能够识别特定的DNA序列。研究表明，甘草中的R2R3-MYB转录因子GlMYB4和GlMYB88含有典型的MYB结构域，能够正调控黄酮类化合物的合成。DREB家族含有保守的AP2/ERF结构域，能够特异性识别和结合DRE/CRT顺式作用元件。研究发现甘草DREB35能够直接结合GuBGLU12和GuOMT1基因的启动子区域，调控黄酮合成途径相关基因的表达。这些结构域特征决定了各转录因子家族特异的DNA结合特性，如bZIP蛋白通过碱性区域识别ACGT核心序列，而DREB蛋白则通过AP2/ERF结构域识别GCC-box等顺式元件。这些结构特征与DNA结合特性的研究为理解甘草转录因子的功能机制提供了重要基础。

2 甘草转录因子在次生代谢调控中的作用

2.1 甘草酸生物合成途径的调控

甘草酸是甘草中最重要的活性成分之一，其生物合成受到多种转录因子的精细调控。研究表明，MYB和bHLH家族的转录因子通过形成调控复合物激活甘草酸合成途径中的关键酶基因表达。例如，β-香树脂醇合成酶和CYP88D6是甘草酸合成途径中的两个关键酶，它们的表达受到MYB和bHLH转录因子的直接调控。在甘草中发现的GlMYB1和GlbHLH3能够协同调控甘草酸合成途径中的多个关键步骤，包括β-香树脂醇的合成及其后续的氧化和糖基化反应。这些转录因子通过结合到靶基因启动子区域的顺式作用元件上，激活下游结构基因的表达，从而促进甘草酸的生物合成。

除了直接的转录调控外，转录因子还通过表观遗传修饰动态调控甘草酸合成相关基因的染色质状态。研究发现，组蛋白乙酰化修饰在甘草酸合成基因的表达调控中发挥重要作用。在茉莉酸甲酯和盐胁迫等诱导条件下，甘草酸合成途径相关基因的染色质区域会出现明显的组蛋白乙酰化修饰变化，这种表观遗传调控与转录因子的作用相互协同，共同促进甘草酸合成相关基因的表达。此外，UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)基因的表达也受到MYB和bHLH转录因子的调控，对甘草酸的最终积累量具有决定性影响。

2.2 黄酮类化合物合成的调控网络

甘草中的黄酮类化合物是另一类重要的活性成分，其合成受到复杂的转录调控网络控制。WRKY家族转录因子在甘草黄酮合成中起关键作用，能够响应环境胁迫调节查尔酮合成酶(CHS)等关键酶基因的表达。在盐胁迫条件下，甘草中多个WRKY转录因子的表达显著上调，同时伴随着黄酮类化合物合成途径中PAL、4CL、CHS和CHI等关键酶基因的表达增加。这些WRKY转录因子通过识别并结合黄酮合成相关基因启动子中的W-box元件，激活这些基因的表达，从而促进黄酮类化合物的积累。

黄酮类化合物的合成还受到转录因子之间复杂互作网络的精细调控。MYB、bHLH和WD40等家族的转录因子可以形成MBW复合物，共同调控黄酮合成相关基因的表达时序和水平。例如，在甘草中发现的R2R3-MYB转录因子与bHLH转录因子相互作用，协同激活黄酮合成途径中多个结构基因的表达。这种转录因子互作网络使得植物能够根据发育阶段和环境条件的变化，精确调控不同种类黄酮类化合物的合成和积累。同时，一些负调控转录因子如MYB4也能够抑制黄酮合成途径中某些基因的表达，形成反馈调节机制，维持黄酮代谢的稳态平衡。

3 甘草转录因子与环境胁迫响应

3.1 非生物胁迫应答机制

甘草作为一种重要的药用植物，在应对干旱、盐碱等非生物胁迫时，其体内的转录因子网络发挥着核心调控作用。研究表明，在干旱胁迫条件下，甘草中特定家族的转录因子表达会显著上调，进而激活一系列抗氧化和渗透调节相关基因，形成复杂的防御网络。例如，对甘草（Glycyrrhiza uralensis）中DREB（脱水响应元件结合）转录因子家族的系统分析发现，该家族包含多个成员，其启动子区域含有丰富的激素响应和胁迫响应顺式作用元件，预示着其功能的多样性。在干旱胁迫下，多个_GuDREB_基因的表达被不同程度地诱导，其中_GuDREB10_在地下部分表达显著增加，而_GuDREB15_在地上部分上调尤为明显，这种组织特异性表达模式可能与启动子中光响应元件的数量有关。更为具体的研究证实，DREB转录因子_GuDREB35_在干旱胁迫下表达被强烈诱导，其过表达能显著增强甘草的耐旱性并促进黄酮类化合物的积累。机制上，_GuDREB35_通过直接结合黄酮合成途径中关键酶基因_GuBGLU12_和_GuOMT1_的启动子，激活抗氧化防御和黄酮生物合成途径，从而提升植株的抗逆能力。此外，NAC家族转录因子在整合多种胁迫信号中也扮演着关键角色。对茉莉酸甲酯（MeJA）和氯化钠（NaCl）诱导下甘草NAC转录因子的转录组学分析显示，差异表达的NAC转录因子参与了淀粉与蔗糖代谢、碳水化合物代谢以及类黄酮、聚酮和萜类化合物途径的调控，表明NAC家族在整合MeJA和NaCl诱导的代谢响应中具有重要作用。这些转录因子介导的信号转导网络能够整合多种胁迫信号，通过协同调控下游的抗氧化、渗透调节及次生代谢途径，形成高效的协同防御机制，从而增强甘草对非生物胁迫的整体耐受性。

3.2 生物胁迫防御反应

当面临病原菌等生物胁迫时，甘草通过激活特定的转录因子来启动防御反应，其中涉及植保素合成途径和病程相关（PR）基因的表达调控。在甘草中，茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导能够显著激活R2R3-MYB类转录因子_GlMYB4_和_GlMYB88_的表达，这两个转录因子被证实定位于细胞核，并能正向调控甘草细胞中黄酮类化合物的积累。这揭示了MYB转录因子在茉莉酸信号诱导的次生代谢防御反应中的直接作用。此外，对三种药用甘草物种（G. uralensis, G. inflata, G. glabra）的比较基因组学研究发现，在胀果甘草（G. inflata）中，bHLH转录因子_GibHLH9_、_GibHLH53_和_GibHLH174_被鉴定为促进甘草甜素合成的关键转录因子，它们分别通过反式激活_GiCSyGT_和_GiUGT73P12_的表达来发挥作用。转录因子通过调控次生代谢的重编程，在生长和防御之间进行资源分配的平衡。综上所述，在生物胁迫下，甘草通过茉莉酸等激素信号途径，激活MYB、bHLH、WRKY等关键转录因子，进而调控植保素合成途径、PR基因表达以及广泛的次生代谢重编程，从而建立起有效的防御体系，并在资源有限的情况下权衡生长与防御的投入。

4 甘草转录因子的研究方法与技术进展

4.1 高通量鉴定与功能预测

RNA-seq技术已被广泛应用于甘草转录因子的表达谱分析，例如在干旱胁迫条件下，通过RNA-seq鉴定出79个GuDREB基因，并发现GuDREB35的表达显著上调。ChIP-seq技术则能够直接捕获转录因子与DNA的结合位点，如研究发现DREB转录因子GuDREB35可直接结合黄酮合成途径关键酶基因GuBGLU12和GuOMT1的启动子区域。单细胞测序技术的引入进一步提升了细胞类型特异性转录因子表达解析的精度，共表达网络分析结合机器学习算法显著提高了功能预测的准确性。此外，比较基因组学分析揭示了三种药用甘草（G. uralensis、G. inflata和G. glabra）中转录因子如bHLH家族成员（GibHLH9、GibHLH53等）对甘草酸合成的调控网络，为转录因子的功能注释提供了系统框架。

4.2 基因编辑与功能验证

CRISPR/Cas9系统在甘草转录因子功能研究中展现出显著优势。例如，通过构建靶向GuDREB35的CRISPR载体并转化甘草，成功实现了该基因的精准敲除，验证了其对干旱耐受性和黄酮积累的正调控作用。病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术为快速验证转录因子功能提供了有效手段，如利用VIGS沉默GuDREB35后，甘草植株的耐旱性和黄酮含量显著降低。报告基因系统（如荧光素酶报告基因）和酵母单杂交技术被广泛应用于转录因子-DNA互作研究，例如通过酵母单杂交证实了GlMYB4和GlMYB88与黄酮合成相关基因启动子的直接结合。此外，双荧光素酶报告系统验证了bHLH转录因子对甘草酸合成酶基因GiCSyGT和GiUGT73P12的转录激活作用。这些技术的结合不仅解决了传统遗传转化效率低的问题，还为解析甘草转录因子的多层次调控机制提供了多维度证据。例如，整合CRISPR编辑、ChIP-seq和转录组分析，揭示了DREB和NAC家族转录因子通过激活抗氧化防御和次级代谢通路调控甘草非生物胁迫响应的分子机制。

5 甘草转录因子研究的应用前景

5.1 药用成分的代谢工程

通过调控关键转录因子表达可定向改造甘草次生代谢途径，提高目标成分含量。甘草中主要的药用活性成分包括甘草酸和多种黄酮类化合物，其生物合成受到一系列转录因子的精密调控。研究表明，MYB、bHLH、NAC和DREB等家族的转录因子在调控这些代谢途径中扮演着核心角色。例如，在胀果甘草中，转录因子GibHLH9、GibHLH53和GibHLH174被鉴定为促进甘草酸合成的关键调控因子，它们通过反式激活甘草酸合成途径中的关键酶基因GiCSyGT和GiUGT73P12的表达来发挥作用。同样，在乌拉尔甘草中，R2R3-MYB转录因子GlMYB4和GlMYB88被证实能够响应茉莉酸甲酯的诱导，正向调控黄酮类化合物的积累。这些发现为通过基因工程手段过表达或抑制特定转录因子，从而定向增强目标代谢物的合成提供了明确的靶点。例如，过表达脱水响应元件结合转录因子GuDREB35不仅能显著增强甘草的耐旱性，还能促进黄酮类物质的积累，其机制在于GuDREB35能够直接结合黄酮合成途径中两个关键酶基因GuBGLU12和GuOMT1的启动子，激活其表达。这证明了单个转录因子可以同时调控抗逆性和次生代谢，为多性状协同改良提供了范例。

合成生物学策略结合转录因子工程有望实现甘草活性成分的异源高效生产。鉴于甘草生长周期长且有效成分含量低，利用微生物或模式植物底盘进行异源合成是突破生产瓶颈的重要方向。转录因子作为调控网络的“总开关”，其引入是重构并优化异源代谢途径的关键。对甘草酸生物合成途径的整合分析发现，其涉及18个结构基因，并与2374个转运蛋白、1040个转录因子、262个转录调节因子和689个蛋白激酶存在共表达关系，这揭示了其背后复杂的调控网络。通过合成生物学方法，可以将这些核心的结构基因与已鉴定的关键转录因子（如调控甘草酸的bHLH因子或调控黄酮的MYB因子）进行模块化组装，导入酵母或烟草等异源系统。例如，在丹参等药用植物的研究中，转录因子工程已被证明是提高目标产物产量的有效策略。对于甘草特有的高价值成分，如来源于胀果甘草的甘草查尔酮A和来源于光果甘草的甘草苷元，其生物合成途径中的基因已在比较基因组学中被分析和鉴定。将负责这些途径的结构基因与相应的转录调控模块相结合，有望在可控的发酵体系中实现这些昂贵原料的高效、可持续生产。

多转录因子协同调控体系的构建是提高代谢工程效率的关键。次生代谢物的生物合成通常不是由单个转录因子独立调控，而是通过多个转录因子形成的复杂网络来实现的，这确保了代谢通量在正确的时间和空间被精确分配。在甘草中，茉莉酸甲酯和氯化钠的诱导能够差异性地影响大量NAC转录因子的表达，这些转录因子参与淀粉与蔗糖代谢、碳水化合物代谢以及萜类、聚酮类和黄酮类代谢途径，共同调控甘草的胁迫响应和次生代谢物积累。这表明环境信号通过激活一组而非单个转录因子来协调初级与次级代谢。因此，在代谢工程中，模拟这种天然的协同调控机制可能比过表达单个因子更为有效。例如，在刺五加中，施加锌肥后，类黄酮和苯丙素类生物合成途径的结构基因上调，并与ERF、WRKY、bHLH、NAC和MYB等多个家族的转录因子显著相关，形成了一个协同调控网络。借鉴此思路，在构建甘草活性成分的异源合成体系时，可以尝试共表达多个存在协同或级联关系的转录因子。例如，同时引入一个MYB转录因子和一个bHLH转录因子，它们可能形成复合物来更有效地激活下游结构基因的转录。这种多因子调控体系的构建，能够更好地模拟植物体内的天然调控逻辑，从而更稳定、高效地驱动整个代谢途径，是实现甘草活性成分代谢工程从概念验证走向工业化生产的关键步骤。

5.2 分子育种与品质改良

转录因子基因作为分子标记辅助选择的重要靶点，可加速优质甘草品种选育。传统甘草育种周期长，且药用成分含量、抗逆性等性状多为数量性状，选择效率低。转录因子作为调控众多下游基因表达的上游关键节点，其等位变异往往对表型有重大影响，因此是开发功能性分子标记的理想靶标。例如，对乌拉尔甘草DREB转录因子家族的分析发现，其启动子区含有大量激素响应和逆境响应的顺式作用元件，且不同成员在干旱胁迫下表达模式各异。其中，GuDREB35被证实是正向调控耐旱性和黄酮积累的关键基因。这些转录因子基因本身的序列多态性或表达水平的差异，可以作为与优良性状紧密连锁的分子标记。通过开发基于这些转录因子基因的分子标记，可以在甘草幼苗期进行基因型筛选，快速鉴定出具有优良等位基因的个体，从而大幅缩短育种周期，实现优质品种的定向选育。

抗逆相关转录因子的利用可培育适应恶劣环境的甘草新品种。甘草野生资源常分布于干旱、盐碱等逆境环境，挖掘其内在的抗逆遗传机制对于培育适应性强、可在边际土地上种植的甘草品种至关重要。在甘草中，DREB转录因子被证实广泛参与干旱和盐胁迫响应。例如，乌拉尔甘草中的GuDREB家族成员在干旱胁迫下表达量发生显著变化，其中GuDREB10和GuDREB15分别在地下部和地上部表现出强烈的上调表达，这与它们启动子中胁迫响应元件的组成以及组织特异性有关。更为重要的是，过表达GuDREB35能直接增强甘草的耐旱性。这些抗逆转录因子基因是宝贵的遗传资源。通过转基因技术或分子标记辅助选择，将强效的抗逆转录因子等位基因导入栽培甘草品种，可以显著提升其抗逆性。对于甘草，比较胀果甘草和乌拉尔甘草的耐盐性差异发现，胀果甘草更强的耐盐性与其碳代谢、凯氏带形成、离子转运、类黄酮和类胡萝卜素生物合成以及相关信号通路和转录因子（如HSF、GRAS家族）的差异表达密切相关。这提示我们可以从耐盐性更强的胀果甘草中复制关键的抗逆转录因子基因，通过基因工程或与乌拉尔甘草杂交并辅助选择，培育出既保持乌拉尔甘草优良药用品质，又具备胀果甘草强耐盐性的新品种，从而拓展甘草的种植范围，保障药材的稳定供应。

6结论

甘草转录因子研究是连接基因型与表型的关键，近年在系统分类、功能解析等方面进展显著，但现有研究多聚焦于单个或少数转录因子的功能验证，对其在时空维度上协同或拮抗调控网络、平衡次生代谢与生长发育的认知仍较碎片化。

未来该领域需实现深度与广度的双重突破，核心在于加强多组学数据整合分析，将基因组、表观组等多维度数据关联，全景解析转录因子的分子作用机制，以此厘清同一转录因子在不同场景下调控效应差异的根源。

总体而言，甘草转录因子研究正处于从描述性发现向机制性解析、基础探索向应用牵引的过渡阶段。未来需以系统整合视角开展研究，依托跨学科技术融合及多方协作，实现从解码自然调控逻辑到理性设计优良性状的跨越，充分挖掘这一传统药用植物的潜在价值。

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