引言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也称“金葡菌”，属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，该菌最适宜生长温度为37℃，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌是人类皮肤的主要定居者，通常存在于环境中，大多情况下无害，但在机体免疫力低下的肿瘤患者、血液病患者、长期卧床患者会增加继发金黄色葡萄球菌感染的机会。由金黄色葡萄球菌引起的继发感染是医院和社区获得性感染相关的主要病原体之一，可引起皮肤轻微感染到伤口感染、血流感染、坏死性肺炎及全身各脏器感染，甚至会导致假体关节、心脏瓣膜和植入装置等异物的患者反复或持续的感染。近年来，由金黄色葡萄球菌引起的感染或继发感染伴随的发病率、死亡率和住院时间的日渐增加，这就给临床治疗带来了巨大的挑战。

本研究将金黄色葡萄球菌A蛋白特异性抗体包被与蓝色羧化聚苯乙烯颗粒表面，建立一种特异性高、敏感性好、操作简便、快速的可视化检测方法，为金黄色葡萄球菌感染的早期快速诊断、指导临床用药提供理论与实践基础。

1 材料及仪器

1.1 样品及试剂

金黄色葡萄球菌（ATCC25923）采购自广东环凯微生物有限公司，肺炎链球菌标准菌株（ATCC49619）采购自上海鲁微科技有限公司，乙型溶血性链球菌标准菌株（ATCC21059）采购自上海鲁微科技有限公司。大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌均为本实验室保存菌种。

羧化聚苯乙烯蓝色乳胶颗粒、叠氮磷酸二苯酯、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐均购自上海麦克林生化科技有限公司；金黄色葡萄球菌蛋白A（北京博尔西科技有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技术有限公司）；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器设备

Thermo Fisher高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司）、THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博讯医疗生物仪器有限公司）、NanoDrop One微量核酸蛋白测定仪（美国Thermo公司）、YXQ-LS-75S11立式蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）。

1.3 试剂配制

0.1 moL/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）：称取0.78 g无水碳酸钠，4.2 g碳酸氢钠，加无菌ddH₂O定容至500 mL。0.02 moL/L磷酸盐缓冲液（pH4.5）：称取3.85 g磷酸氢二钠，加无菌ddH₂O定容至500 mL。0.01 moL/L磷酸盐缓冲液（pH4.7）：称取1.36 g磷酸氢二钾，加HCL调pH4.7，溶于500 mL无菌ddH₂O中。0.1 moL/L 硼酸盐缓冲液（pH8.0）：称取0.07 g无水硼酸钠，0.3 g硼酸，4.75 g氯化钠溶于500 mL无菌ddH₂O中。乳胶储存液：总体积5%的甘油，0.01%的牛血清白蛋白，0.1%的叠氮磷酸二苯酯（97%），用0.01 moL/L磷酸盐缓冲液定容至500 mL。2%碳二亚胺（EDC）：称取购买98.5%的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐2 mL，98 mL的磷酸盐缓冲液配制成2%的EDC。0.1 moL/L甘氨酸：称量3.054 mL甘氨酸溶液加入500 mL无菌ddH₂O充分溶解。

2 实验方法

2.1 羧化乳胶包被蛋白抗体

2.1.1 羧化致敏乳胶的方法

取400 μL、2.5%羧化聚苯乙烯乳胶颗粒置于离心管中（注意取之前把乳胶液摇匀），加入1000 μL体积的碳酸盐缓冲液（pH=9.6），14000 g离心15 min，弃上清。沉淀用1000 μL的碳酸盐缓冲液悬起，同上条件离心，重复2次。取1000 μL磷酸缓冲液（pH=4.5）按以上方法洗涤3遍，用磷酸盐缓冲液配制2% EDC 1000 μL，悬起洗涤过的乳胶沉淀，置于摇床上反应3 h。偶联结束后的乳胶用硼酸缓冲液（pH=8.0）1000 μL，洗涤3遍，最后用硼酸缓冲液悬起乳胶吹匀，加入蛋白抗原400 μL，摇床作用4 h。在致敏后的乳胶加入甘氨酸终止剂，剂量为每400 μL、1%羧化乳胶中加入20 μLBSA溶液，终止反应时间为15 min，之后离心，用硼酸缓冲液冲洗3遍，最终乳胶用乳胶储存液悬浮，4℃保存。

2.1.2 最佳偶联蛋白浓度的选择

将SPA蛋白抗体进行50～250 μg/mL（50、100、150、200、250）的不同浓度后，用硼酸缓冲液调至其最终含量600 μL，在室温摇床作用4 h，12000 g离心6 min，收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量，计算上清中蛋白抗体的偶联效率，通过反应前后的蛋白浓度变化求得。

2.1.3 最佳偶联时间的选择

在100 μL 1%的羧化乳胶中，加入上述测得的最佳蛋白浓度的蛋白抗体，改变致敏时间，分别致敏1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、12 h，致敏后离心收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量，通过凝集效果的观察，根据2.1.2中的偶联效率公式计算偶联效率。

2.1.4 最佳羧化乳胶浓度的选择

在确定上述条件的前提下，改变乳胶最终致敏浓度，使致敏乳胶终浓度分别为2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%。在室温摇床作用4 h，12000 g离心6 min，收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量，根据2.1.2中的偶联效率公式计算上清中蛋白抗体的偶联效率。

2.1.5 乳胶凝集试验检测操作及其结果的判定

在载玻片上滴约20 μL待检菌悬液，在菌悬液上滴约20 μL致敏乳胶悬液，用牙签迅速将两者混匀，慢慢摇动载玻片1～2 min，使其形成直径为1～1.5 cm的液面，黑色背景下，3～5 min内肉眼观察，同时设定阳性和阴性对照。

检测样品出现50 %以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，不出现凝集则判为阴性。鉴定方法能够直接准确鉴定是否为金黄色葡萄球菌感染。

2.2 致敏包被抗体乳胶的质量检测

2.2.1 蓝色乳胶凝集特异性评价

在载玻片上分别滴约20 μL金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌菌悬液，之后分别取20 μL致敏乳胶悬液滴在菌悬液上，慢慢摇动载玻片，使之充分混匀，黑色背景下，3～5 min内肉眼观察结果。

2.2.2 蓝色乳胶凝集敏感性试验

将金黄色葡萄球菌菌悬液用磷酸盐缓冲液从1:2至1:256进行倍比稀释，分别与20 μL致敏乳胶悬液滴在菌悬液上，慢慢摇动载玻片，使之充分混匀，黑色背景下，3～5 min内肉眼观察结果。

2.2.3 蓝色乳胶凝集重复性试验

利用已经构建的乳胶凝集试剂，分别在三个不同实验室由三名不同操作人员进行相同检测品的验证，乳胶凝集试验进行重复性验证，观察并记录结果。

2.2.4 蓝色乳胶凝集稳定性试验

乳胶凝集检测体系4℃低温保存，分别在制备后的6、9、12个月进行乳胶检测体系的稳定性，观察并记录结果。

2.2.5 蓝色乳胶凝集临床标本检出率

用上述制备的乳胶凝集检测体系对临床标本进行验证，观察并记录结果。

3 结果与分析

3.1 最佳乳胶包被抗体条件的确定

3.1.1 最佳偶联蛋白浓度的确定

在1%浓度的蓝色羧化乳胶中，分别加入浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL金黄色葡萄球菌A蛋白抗体，偶联4 h，离心收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量。通过2.1.2偶联效率公式求最佳偶联蛋白浓度，根据表1结果显示，当金黄色葡萄球菌A蛋白抗体浓度为250 μg/mL时，偶联效率为78.8%，偶联率最高。

SPA初始加入浓度（μg/mL）	偶联到乳胶上的蛋白量（μg/mL）	偶联效率%
50	8.3	16.6
100	34.3	34.3
150	32.7	21.8
200	85.3	42.7
250	197.0	78.8
300	186.0	62.0
350	186.0	53.1

3.1.2 最佳偶联时间的确定

在浓度为1%的羧化乳胶中，加入浓度为250 μg/mL的金黄色葡萄球菌A蛋白抗体，改变致敏时间，分别在2 h、4 h、6 h、10 h、12 h进行致敏，致敏后离心收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量。通过2.1.2偶联效率公式求偶联率，根据表2结果显示，当致敏时间为4 h时，偶联效率为78.8%，偶联率最高。

偶联时间h	初始加入蛋白浓度（μg/mL）	偶联到乳胶上的蛋白浓度（μg/mL）	偶联效率%
2	250	185.7	74.28
4	250	197.0	78.80
6	250	130.7	52.28
10	250	122.3	48.92
12	250	88.33	35.33

3.1.3 最佳羧化乳胶浓度的确定

在确定上述条件的基础上，改变羧化乳胶最终致敏浓度，使乳胶颗粒最终致敏浓度为0.25%、0.5%、1%、2%，在室温作用4 h后，离心收集上清，经微量核酸蛋白测定仪测定上清中剩余蛋白量。通过2.1.2偶联效率公式求偶联率，根据表3结果显示，当羧化乳胶终浓度为1%时，偶联效率为83.48%，偶联率最高。

羧化乳胶浓度%	偶联时间h	SPA初始加入浓度（μg/mL）	偶联到乳胶上的蛋白量（μg/mL）	偶联效率%
0.25	4	250	170.33	68.13
0.5	4	250	178.33	71.33
1	4	250	208.70	83.48
2	4	250	169.00	67.60

3.2 乳胶凝集试剂的质量检测

3.2.1 乳胶凝集试剂特异性评价

结果显示，致敏好的乳胶凝集试剂与金黄色葡萄球菌菌悬液短时间内出现明显的蓝色凝集颗粒，反应呈强阳性，与肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌菌悬液均不反应，证明乳胶凝集试剂特异性良好。

3.2.2 乳胶凝集试剂灵敏度评价

将制备的金黄色葡萄球菌菌悬液从1:2至1:256进行倍比稀释，分别与制备好的乳胶凝集试剂反应，结果显示，菌悬液稀释至1:64时，检测灵敏度最低。

3.2.3 乳胶凝集试剂重复性评价

不同人员、不同实验室检测结果显示，将金黄色葡萄球菌菌悬液与制备好的乳胶凝集试剂反应后，立刻出现蓝色凝集颗粒，证明乳胶凝集试剂重复性良好。

3.2.4 乳胶凝集试剂稳定性评价

将课题组制备的乳胶试件低温4℃保存不同时间后，乳胶凝集试剂均能检测出金黄色葡萄球菌，菌悬液与乳胶试剂混匀后立刻出现蓝色乳胶凝集颗粒，实验结果符合预期，证明乳胶凝集试剂稳定性良好。

3.2.5 乳胶凝集试剂临床标本检出情况评价

将本课题组制备的乳胶凝集试剂与26例临床标本分离培养后的菌株进行反应，结果分析表明，乳胶凝集试剂检出率为88.46%，结果符合临床检出预期。见表4。

细菌鉴定	乳胶凝集法		培养法
	阳性	阴性	阳性	阴性
金黄色葡萄球菌	23	3	24	2

4 讨论

近年来，由金黄色葡萄球菌感染的患者滥用抗生素、疗程长、抗菌谱广、联合用药多，使体内正常菌群的生态平衡遭到破坏，菌群失调，导致耐药金黄色葡萄球菌大量增殖，极易导致患者继发感染。金黄色葡萄球菌是一种重要的医院内病原菌。金黄色葡萄球菌引起的感染仍然是全球重大的健康威胁。由金黄色葡萄球菌引起的血流感染可危及生命，给感染控制和临床治疗带来巨大挑战。因此快速准确检测金黄色葡萄球菌感染就显得非常重要。

目前，常用的金黄色葡萄球菌的检测方法有传统培养法、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增方法等，“金标准”的传统培养结合形态学鉴定，检测结果时间长，因个人主观因素会造成误差，导致临床应用受限；张小雨应用新型的环介导等温扩增方法检测金黄色葡萄球菌，虽然反应过程不需要特殊仪器，但结果没法可视化；李金桂等人应用实时荧光核酸恒温扩增技术检测金黄色葡萄球菌，检测过程需荧光进行标记，荧光染料也会造成污染，至今未进行广泛开展；陆文俊将金黄色葡萄球菌特殊靶点与PCR技术相结合，建立PCR反应，但该反应需特殊大型仪器且需专业技术人员。

然而新型的乳胶凝集反应将免疫学技术与微生物学相结合，乳胶凝集实验利用金黄色葡萄球菌表面具有特异性葡萄球菌A蛋白抗体将其与蓝色羧化聚苯乙烯进行一系列反应后，用来检测是否由金黄色葡萄球菌感染所致。使其检测结果具有高度特异性、该方法在普通增菌24 h后，仅需10 s即可出结果，具有检测结果准确，操作简便，快速，结果容易观察，非专业人员和小型实验室也能进行等优点。孙殿刚利用乳胶凝集试验检测水貂阿留申病；杨宁基于乳胶凝集技术对沙门菌进行快速可视化检测；罗玲基于乳胶凝集技术快速可视化检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7。乳胶凝集技术应用与临床由金黄色葡萄球菌感染所致疾病的快速可视化检测，将为检查人员的诊断提供更为准确便捷的检测手段。

本实验以金黄色葡萄球菌标准菌株为研究对象，将金黄色葡萄球菌表面A蛋白抗体与蓝色羧化聚苯乙烯颗粒发生偶联结合，通过对偶联条件进行优化摸索建立，所建立的乳胶凝集试验特异性高，灵敏度低至1:64，重复性好，稳定性强。应用本课题组自行建立的乳胶凝集技术对于临床26株金黄色葡萄球菌进行检测，检出率为88.46%。金黄色葡萄球菌制成菌悬液后，只需在载玻片上滴加乳胶溶液与菌悬液发生结合30 s内观察结果，可以实现金黄色葡萄球菌感染的可视化、特异性检测。随着新型免疫技术的兴起，将这些技术与微生物相结合，成为未来快速检测的新方向。

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